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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸遮盖组学、LC-MS/MS磷过酸位点分析一下技术服务。
日语微信标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文版题头：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
的客户的单位：山东大学
学习资料：拟南芥侧根
拜谱可以提供技巧：磷酸性反应遮盖组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点探讨
学习指导思想：
PART 01 理论研究最后
01、出现素有利于VIK的磷硝化作用十分转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷碱化球脂肪酸多组分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 成长素可以淡化VIK的磷碱化举例转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化试验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过鲜酵母双混种杂交进行分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶相互依存显像研究（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且休外磷过酸实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时路况酶联免疫法PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素数据积极性调节作用 LR 发展
用讲解两大VIK T-DNA加入人类基因遗传变化率体（vik-2和vik-3），察觉与野外型相比较，人类基因遗传变化率体的LR孔隙率、LR原基（LRP）和已健康成长的LR明显下降，十分是vik-2（图2）。恰恰相反，过把你想呈现出来VIK的转人类基因遗传茎秆呈现出LR孔隙率增高。除此之外，在vik-2人类基因遗传变化率体底色下把你想呈现出来VIK的转人类基因遗传茎秆恢复原状了LR健康成长的缺陷。生長素处里实验室表面，vik-2人类基因遗传变化率体对生長素帮助的LR健康成长反馈弱化，表面VIK在生長素自我调节LR健康成长中更好地发挥要点用处。 
图2 VIK介导的生长期素数字信号径路正向着调节LR的成长
03、VIK 与ERF13 实施数学互交
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双团伙荧光同质 （BiFC）和免疫力共滤渣实验操作（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13主动功用
04、VIK以双面馈的具体方法调整ERF13磷酸性反应
通过磷碱化蛋清组学数据分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点转变发现了显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈办法磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷过酸增进ERF13化学降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体实验性所和内实验性所，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸虚拟仿真和磷酸解离变化体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚内部精准定位了解表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸性反应1了ERF13挥发
06、VIK 介导的 ERF13 磷酸性反应调控 LR 的冒出
深入分析进每一步论述了VIK国家宏观调控的ERF13分解在侧根（LR）发育状况中的效果。依据相比有差异 转表观遗传植被系的LR表型，遇到过抒发ERF13促使了LR的显现，在vik基因基因变异体中各种促使效果削弱，而在过抒发YFP-VIK的历史背景下各种促使效果削弱（图6）。与此同时，相比ERF13的有差异 磷酸性反应虚拟和磷酸解离基因变异体的过抒发植被系，遇到ERF132A-Myc（磷酸解离）的植被系LR显现少点，而ERF132D-Myc（磷酸性反应虚拟）的植被系LR显现略多。一些后果认为，VIK介导的ERF13磷酸性反应和分解提高了LR的显现。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸提高LR的突然出现
07、VIK在侧根大中磷硝化作用并保持稳定LBD18球蛋白
经由分享两位VIK T-DNA读取变化体（vik-2和vik-3），发掘与也是型相较于，变化体的侧根（LR）相对相对密度、LR原基（LRP）和已的萌发健康发肓健康发肓状况的LR差异性极大减少，更是要格外重视是vik-2（图7）。不同，过抒发VIK的转什么是dna茎叶表现形式出LR相对相对密度加剧。不仅，在vik-2变化体后台下抒发VIK的转什么是dna茎叶医治了LR的萌发健康发肓健康发肓状况不足。的萌发健康发肓素解决实验设计表面，vik-2变化体对的萌发健康发肓素引诱的LR的萌发健康发肓健康发肓状况反馈衰弱，表面VIK在的萌发健康发肓素自我调节LR的萌发健康发肓健康发肓状况中展现的关键效果。 
图7 VIK 在LR造成操作过程中简单磷硝化作用和稳定可靠LBD18蛋白酶
PART 02 文章内容个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用核苷酸质组学深入分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的发展素警报调理侧根成型
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的血清质组学、突显血清质组学、分解代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超标淬硬层DIA·磷酸性反应遮盖组，采用创新生物富集能力+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现宠物样例10w+、草本花卉样例5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参看资料：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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